生物顯微鏡與光學濾光片

2012-03-08 giai

生物顯微鏡與光學濾光片 (此文章為轉(zhuǎn)載)

生物顯微鏡與光學濾光片

(圖源網(wǎng)絡,侵刪)

一、暗視野顯微鏡

(一) 原理和結(jié)構(gòu)特點 

在日常生活中,室內(nèi)飛揚的微粒灰塵是不易被看見的,但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來,灰塵便粒??梢娏耍@是光學上的丁達爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設計的。它的結(jié)構(gòu)特點主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器,常用的是拋物面聚光器,使光源的中央光束被阻擋.不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑,傾斜地照射在觀察的標本上,標本遇光發(fā)生反射或散射,散射的光線投入物鏡內(nèi),因而整個視野是黑暗的。


在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像.并非物體的本身,所以只能看到物體的存在和運動,不能辨清物體的細微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時,并大于1/2波長,則各級衍射光線同時進入物鏡,在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結(jié)構(gòu),但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動,這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性,可用以觀察活細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒的運動等。 


(二) 制作中央遮光板 
普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的,支架的口徑適于安裝暗視野聚光器,即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時,可用厚黑紙片制作一個中央遮光板,放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上,也能得到暗視野效果。

1.將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位置,用低倍鏡對好焦距。 

2.取下目鏡,從鏡筒中觀察并調(diào)節(jié)光闌的大小,使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等。 

3.用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同,中央部分的大小與調(diào)節(jié)好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片,放在通光孔處聚光鏡鏡面上,紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑,再用圓規(guī)量取大小)。 

4.將中央擋光板放在濾光片框架上,開大光闌進行樣品觀察。 

如需使用高倍鏡作暗視野觀察,應按高倍鏡對焦后的視野大小重新制作中央擋光板。 

保存好各自制作的中央遮光板,以便在后面的實驗中使用。 


(三)使用方法 

1.把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。 

2.選用強的光源,但又要防止直射光線進入物鏡,所以一般用顯微鏡燈照明。 

3.在聚光器和標本片之間要加一滴香柏油,目的是不使照明光線于聚光鏡上面進行全反射,達不到被檢物體,而得不到暗視野照明。 

4.升降集光器,將集光鏡的焦點對準被檢物體,即以圓錐光束的頂點照射被檢物。如果聚光器能水平移動并附有中心調(diào)節(jié)裝置,則應首先進行中心調(diào)節(jié),使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。 

5.選用與聚光器相應的物鏡,調(diào)節(jié)焦距 操作方法與普通顯微鏡相同,找到所需觀察的物像。 


(四)觀察 觀察示教臺上暗視野顯微鏡下的活細胞。在黑暗的背景里,可見細胞、細胞核和細胞器的衍射光圖像。 


二、相差顯微鏡 

(一) 原理和結(jié)構(gòu)特點 

光波有振幅(亮度)、波長(顏色)及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。當光通過物體時,如波長和振幅發(fā)生變化,人們的眼睛才能觀察到,這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本,因細胞各部微細結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同,光波通過時,波長和振幅并不發(fā)生變化,僅相位有變化(相應發(fā)生的差異即相差),而這種微小的變化,人眼是無法加以鑒別的,故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位,并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象,把相差變成振幅差(明暗差),同時它還吸收部分直射光線,以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。 

相差顯微鏡(圖2-3)與普通顯微鏡的主要不同之處是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌,用帶相板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡,并帶有一個合軸用的望遠鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌,它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相板安裝在物鏡的后焦面處,相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外,還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠鏡是用來進行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時,聚光鏡下面環(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上,必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊,才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂,應被吸收的光不能吸收,該推遲相位的光波不能推遲,就失去了相差顯微鏡的作用。 


(二)使用方法 相差裝置為多功能系列顯微鏡中的附屬裝置.與普通顯微鏡配合使用。

1.相差裝置的調(diào)換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器,將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上,把綠色濾光片放在上面,它可吸收紅色和藍色光,使波長范圍小的單色光線進行照明,并有吸熱作用,能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡,換上相差物鏡。 

2.調(diào)焦 打開光源,旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤,將“o”對準標示孔,使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡,按普通顯微鏡操作方法進行對光和調(diào)焦。 旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌,使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應,如相差物鏡為40 x時應用x40標示孔的光闌。 

3.合鈾調(diào)整 拔出目鏡,插入合鈾望遠鏡,一邊從望遠鏡內(nèi)內(nèi)觀察,并用左手固定其外筒;一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠鏡內(nèi)筒使其下降,當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán),此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致,然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕,使兩環(huán)完全重合<圖2—4,如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時,應降低集光器使亮環(huán)放大;反之,則應升高聚光器,使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合,則可能是載玻片過厚之故,應更換。合抽調(diào)整完畢,抽出望遠鏡,換回目鏡,按常規(guī)要領(lǐng)進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時,每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調(diào)整。使用油鏡時,集光器上透鏡表面與載玻片之間要同時加上香伯泊。 


(三)觀察 在相差顯微鏡下觀察活細胞,可清楚地分辨細胞的形態(tài),細胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒狀結(jié)構(gòu)。

三、熒光顯微鏡 

(一)原理和結(jié)構(gòu)特點 

熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源,經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后,再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下,即使熒光很微弱也易辨認,敏感性高,主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學成分等的研究。 熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W),它可發(fā)出各種波長的光,但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長,所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片),僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上,而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后,在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性,一般都比激發(fā)光弱,為能觀察到專一的熒光,在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二:一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過,表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

熒光顯微鏡就其光路來分有兩種:

1.透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的(圖2—5)。常用暗視野集光器,也可用普通集光器,調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強,而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱.所以對觀察較大的標本材料較好。

2.落射式熒光顯微鏡 這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡,與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2-6)。光路中需加上一個雙色束分離器,它與光鈾呈45。角,激發(fā)光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開,殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數(shù)愈大熒光愈強。


(二)使用方法.

1.打開燈源,超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。 

2.透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片,在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的插塊。 

3.用低倍鏡觀察,根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置,調(diào)整光源中心,使其位于整個照明光斑的中央。 

4.放置標本片,調(diào)焦后即可觀察。 使用中應注意:末裝濾光片不要用眼直接觀察,以免引起眼的損傷;用油鏡觀察標本時,必須用無熒光

特殊油鏡;高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開,需經(jīng)5分鐘后才能再啟動,否則會不穩(wěn)定,影響汞燈壽命。

(三)觀察 在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片,可見經(jīng)o.01%的丫啶橙熒光染料染色的細胞,細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。